大肠杆菌DNA残留定量检测试剂盒说明书
货号：71023
 
一. 试剂盒简介
大肠杆菌残留 DNA 检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的大肠杆菌 宿主细胞DNA。本试剂盒利用荧光探针原理，定量检测样本中大肠杆菌残留DNA检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 级别。试剂盒配套有大肠杆菌 DNA定量参考品，已溯源至国家标准品。
 
二．试剂盒组份
表 1.试剂盒组份

组份	装量	数量	储存条件
大肠杆菌 DNA 定量参考品	75ng/瓶	1瓶	-20℃
大肠杆菌 qPCR 检测试剂 （荧光定量PCR试剂，含ROX校正染料）	680ul/瓶	3瓶	-20℃，避光
复溶液	1.5ml/瓶	3瓶	2-8℃及以下

 
  规格：100 Reactions。
  有效期: 规定储存条件下 12 个月。
 
  已测试机型：
  PRISM® 7500 Real-Time PCR System (ABI)
  CFX96 (Bio-Rad)
  LineGene 9600 (博日)
  Roche 480 Lightcycler
 
三、实验所需但试剂盒中未含材料
  1.5ml 无菌低吸附离心管
  1000μl，100μl，10μl 无菌低吸附带滤芯枪头
  相关设备
  荧光定量 PCR 仪
  1000μl，100μl，10μl 移液枪
 
四、操作流程
4．1大肠杆菌 DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备
将试剂盒中提供的 大肠杆菌 DNA冻干定量参考品75ng,使用 0.5ml 复溶液溶解 。之后按照如下步骤依次稀释至浓度为 150ng/ml、15ng/ml、1.5ng/ml、0.15ng/ml、0.015ng/ml。
具体操作如下：
1.  向试剂盒中提供的 大肠杆菌 DNA 冻干品中加入 0.5mL DNA复溶液，盖好胶塞，轻微振荡混匀，此样品为ST1。
2.  取 5 支干净的 1.5ml 离心管，分别标记为 ST0 ， ST2， ST3，ST4，ST5。
3.  每管分别加入 90μl DNA 复溶液。
4.  取 10μl 的  大肠杆菌 DNA 定量参考品 ST1，加入 ST2 管，瞬时振荡混匀后短时间快速离心 5s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA复溶液充分混匀。
5.  按表 2 依次进行稀释操作，稀释步骤同 4。
 表 2. 大肠杆菌 DNA 定量参考品的稀释

稀释管	稀释体积	浓度(ng/ml)
ST1	1瓶DNA 定量参考品+500μl DNA复溶液	150
ST2	10μl ST1+90μl DNA复溶液	15
ST3	10μl ST2+90μl DNA复溶液	1.5
ST4	10μl ST3+90μl DNA复溶液	0.15
ST5	10μl ST4+90μl DNA复溶液	0.015
ST0	90μl DNA 复溶液	0

已融化未使用的 DNA 复溶液可保存于 -20℃。
 
4.2 加样回收质控 ERC 的制备
根据需要设置 ERC 中的  大肠杆菌 DNA 加样浓度（以制备加0.15 ng/ml   大肠杆菌 DNA 量的样本 ERC 为例），具体操作如下：
1.  取 100μl 待测样本加入 1.5ml 干净的离心管中。
2.  再加入 10μl ST3，混匀，标记为样本 ERC。
   样本 ERC 和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成样本 ERC 纯化液。
 
4.3 阴性质控 NCS 的制备
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
1. 取100μl 样本基质溶液(或DNA 复溶液)加入 1.5ml 干净的离心管中标记为阴性质控 NCS。
   阴性质控 NCS 和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
 
4.4 qPCR 反应液的制备和加样
1.  根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样本×2）×3
   待测样本×2 是因为我们推荐每个待测样本检测时都应同时做样本ERC。
2.  从试剂盒内取出 大肠杆菌 qPCR 检测试剂一管，室温下使其完全融化。
3.  根据反应孔数计算本次所需的 大肠杆菌 qPCR MIX 总量：
      大肠杆菌 qPCR MIX =（反应孔数+1）× 20μl（含有 1 孔的损失量）
4.  各试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表 3 所示加样： 表 3.各反应孔加样示例

标准曲线	20μl  大肠杆菌 qPCR MIX + 5μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5
NTC	20μl  大肠杆菌 qPCR MIX + 5μl DNA 复溶液
NCS	20μl  大肠杆菌 qPCR MIX + 5μl NCS 纯化液
待测样本	20μl  大肠杆菌 qPCR MIX + 5μl 待测样本纯化液
样本 ERC	20μl  大肠杆菌 qPCR MIX + 5μl 样本 ERC 纯化液

 
   加样完成后每孔总体积为 25μl。，检测试剂含有ROX染料。
 

NTC

S1

S1

S1

S1 ERC

S1 ERC

S1 ERC

A

NTC

S2

S2

S2

S2 ERC

S2 ERC

S2 ERC

ST5

ST5

ST5

B

NTC

S3

S3

S3

S3 ERC

S3 ERC

S3 ERC

ST4

ST4

ST4

C

S4

S4

S4

S4 ERC

S4 ERC

S4 ERC

ST3

ST3

ST3

D

NCS

S5

S5

S5

S5 ERC

S5 ERC

S5 ERC

ST2

ST2

ST2

E

NCS

ST1

ST1

ST1

F

NCS

G

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

 
   该示例表示的是检测5 个浓度梯度的 大肠杆菌 DNA 标准曲线（ST1～ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样本（S1～S5）和每个样本的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每个检测做 3 个重复孔。
   实际检测时可根据样本多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
5.  将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10s 后放入 qPCR 仪。
 
五．qPCR 程序参数设置
以 AB 公司 7500 qPCR 仪、软件版本 12.4 3 为例。
1.  创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2.  创建新检测探针，命名为  大肠杆菌-DNA，选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX。
3.  设置两步法反应程序：95℃预变性 10min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40 个循环；反应体积 25μl 。
 
 
六. qPCR 结果分析
   以 AB 公司 7500 qPCR 仪、软件版本 12.4 3 为例。
1.  在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2.  在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为15030ng/ml、153ng/ml、1.50.3ng/ml、0.150.03ng/ml、0.0030.015ng/ml，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
3.  在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样本孔、样本 ERC 孔的Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏
中命名为 NTC、NCS、S、ERC，之后点击 。
4.  在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5.  在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控 NCS、待测样本、样本 ERC 的检测值， 单位为ng/ml。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μl 或pg/ml。
七．其他  
结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版 本，一般也可由仪器自动判读。
    根据待测样本和样本 ERC 的检测结果计算加样回收率， 加样回收率要求在 50%～150%之间。
   阴性质控 NCS 的 Ct 值应大于标曲最低浓度 Ct 均值。
   无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35。