Vero细胞DNA残留定量检测试剂盒说明书
货号：71022

• 试剂盒简介

VERO 残留 DNA 检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的 VERO 宿主细胞DNA，试剂盒采用荧光探针原理，定量检测样本中 VERO 残留DNA。具有检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 级别等特点。试剂盒内含 VERO DNA 定量参考品，已溯源至国家标准品。
 

• 试剂盒组份

组份	装量	数量	储存条件
VERO DNA 定量参考品	15ng/瓶	1瓶	2-8℃及以下
VERO 荧光定量PCR试剂 （含ROX校正染料）	680uL/瓶	3管	-20℃，避光
复溶液	1.5ml/瓶	3瓶	2-8℃及以下

 

• 规格：100 Reactions。
• 有效期: 规定储存条件下 12 个月。
• 已测试机型：

PRISM® 7500 Real-Time PCR System (ABI)
CFX96 (Bio-Rad)
LineGene 9600 (博日)
Roche 480 Lightcycler
 

• 实验所需但试剂盒中未含材料

1.5ml 无菌低吸附离心管
1000μl，100μl，10μl 无菌低吸附带滤芯枪头
相关设备
荧光定量 PCR 仪
1000μl，100μl，10μl 移液枪
操作过程
 

• VERO DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

将试剂盒中提供的VERO DNA冻干定量参考品15ng,使用 0.5ml 复溶液溶解 。之后按照如下步骤依次稀释至浓度为 30ng/ml、3ng/ml、0.3ng/ml、0.03ng/ml、0.003ng/ml(3fg/ul)。
具体操作如下：

1. 向试剂盒中提供的VERO DNA 冻干品中加入 0.5mL DNA复溶液，盖好胶塞，轻微振荡混匀，此样品为ST1。
2. 取 5 支干净的 1.5ml 离心管，分别标记为 ST0，ST2，ST3，ST4，ST5。
3. 每管分别加入 90μl DNA 复溶液。
4. 取 10μl 的 VERO DNA 定量参考品 ST1，加入 ST2 管，瞬时振荡混匀后短时间快速离心 5s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA复溶液充分混匀。
5. 按表 1 依次进行稀释操作，稀释步骤同 4。

表 1. VERO DNA 定量参考品的稀释

稀释管	稀释体积	浓度(ng/ml)
ST1	1瓶VERO DNA 定量参考品+500μl DNA复溶液	30
ST2	10μl ST1+90μl DNA复溶液	3
ST3	10μl ST2+90μl DNA复溶液	0.3
ST4	10μl ST3+90μl DNA复溶液	0.03
ST5	10μl ST4+90μl DNA复溶液	0.003
ST0	90μl DNA 复溶液	0

   已融化未使用的 DNA 复溶液可保存于 2-8℃及以下。

• 加样回收质控 ERC 的制备

根据需要设置 ERC 中的 VERO DNA 加样浓度（以制备加 0.03ng/ml  VERO DNA 量的样本 ERC 为例），具体操作如下：

1. 取 100μl 待测样本加入 1.5ml 干净的离心管中。
2. 再加入 10μl ST3，混匀，标记为样本 ERC。

样本 ERC 和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成样本 ERC 纯化液。
 

• 阴性质控 NCS 的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

1. 取100μl 样本基质溶液(或DNA 复溶液)加入 1.5ml 干净的离心管中标记为阴性质控 NCS。

   阴性质控 NCS 和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
 

• qPCR 反应液的制备和加样

1. 根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
2. 反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样本×2）×3

   待测样本×2 是因为我们推荐每个待测样本检测时都应同时做样本ERC。

3. 从试剂盒内取出VERO 荧光定量PCR试剂一管，化冻至完全融化，置于冰上。
4. 按表 2 所示加样：

表 2.各反应孔加样示例

标准曲线	20μl VERO 荧光定量PCR试剂 + 5μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5
NTC	20μl VERO 荧光定量PCR试剂 + 5μl DNA 复溶液
NCS	20μl VERO 荧光定量PCR试剂 + 5μl NCS 纯化液
待测样本	20μl VERO 荧光定量PCR试剂 + 5μl 待测样本纯化液
样本 ERC	20μl VERO 荧光定量PCR试剂 + 5μl 样本 ERC 纯化液

   加样完成后每孔总体积为 25μl，本冻干试剂含有ROX染料。
 
表 3. 96 孔板排版示例

NTC

S1

S1

S1

S1 ERC

S1 ERC

S1 ERC

A

NTC

S2

S2

S2

S2 ERC

S2 ERC

S2 ERC

ST5

ST5

ST5

B

TC

S3

S3

S3

S3 ERC

S3 ERC

S3 ERC

ST4

ST4

ST4

C

S4

S4

S4

S4 ERC

S4 ERC

S4 ERC

ST3

ST3

ST3

D

NCS

S5

S5

S5

S5 ERC

S5 ERC

S5 ERC

ST2

ST2

ST2

E

NCS

ST1

ST1

ST1

F

NCS

G

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

 
   表3为孔板排布示例图，该示例表示的是检测5 个浓度梯度的VERO DNA 标准曲线
（ST1～ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样本（S1～S5）和每个样本的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每个检测做 3 个重复孔。实际检测时可根据样本多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
5.  将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10s 后放入 qPCR 仪。
 

• qPCR 程序参数设置

以 AB 公司 7500 qPCR 仪、软件版本 2.3 为例。

1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，命名为 VERO-DNA，选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX。
3. 设置两步法反应程序：95℃预变性 10min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40 个循环；反应体积 25μl 。

 
 

• qPCR 结果分析

   以 AB 公司 7500 qPCR 仪、软件版本 2.3 为例。

1. 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为30ng/ml、3ng/ml、0.3ng/ml、0.03ng/ml、0.003ng/ml，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
3. 在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样本孔、样本 ERC 孔的Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S、ERC，之后点击 。
4. 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5. 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控 NCS、待测样本、样本 ERC 的检测值，单位为ng/ml。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μl 或pg/ml。

   结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版 本，一般也可由仪器自动判读。
   根据待测样本和样本 ERC 的检测结果计算加样回收率， 加样回收率要求在 50%～150%之间。
   阴性质控 NCS 的 Ct 值应大于标曲最低浓度 Ct 均值。
   无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35。